7月29日，bet365 코리아 - 신뢰할 수 있는 사이트佘群新教授团队与哥本哈根大学蛋白质研究中心Guillermo Montoya教授团队合作，在Molecular Cell（《分子细胞》）杂志在线发表了题为“Structure of the Cmr-β Complex Reveal the Regulation of the Immunity Mechanism of Type III-B CRISPR-Cas”的研究论文。bet365 코리아佘群新教授与和哥本哈根大学蛋白质研究中心Guillermo Montoya教授为该研究的共同通讯作者，Guillermo Montoya组的Nicholas Sofos（博士后）与佘群新组冯明霞（博士后）为共同一作。bet365 코리아 - 신뢰할 수 있는 사이트为第二通讯单位。该项研究工作得到了转基因国家重大研发计划项目、国家自然科学基金委面上项目等基金的资助。

该研究通过Cryo-EM手段解析了来自嗜热古菌-冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus, Sis）的Cmr-β复合物（Cmr蛋白和crRNA）的七种不同状态的三维结构。该研究结合结构解析与生化实验数据阐释了III-B型Cmr-β复合物避免自身免疫与同源靶标RNA激活免疫的机制。

CRISPR-Cas系统是原核生物中由小RNA介导的获得性免疫系统，用于抵御外源移动遗传元件1-3。根据复合物中的标志Cas蛋白，CRISPR-Cas系统被划分为I~VI型，其中I、III和VI型的RNP复合物含多种不同功能的Cas蛋白，归类为Class 1；而II、IV和V型只有单体多功能的Cas蛋白，归类为Class 2 4。    III型系统具有多种免疫活性，分别为靶标RNA间隔6碱基切割活性，同源靶标RNA激活的单链DNA切割活性与环状寡聚腺苷酸（cyclic oligoadenylates, cOA）合成活性5,6。III-A（Csm）与III-B（Cmr）系统作为III型系统目前发现的两个大亚类型，现只有报道研究III-A型复合物被同源靶标RNA激活的分子机理7-9，但对于III-B型复合物的系统性机理研究目前还缺乏。

该研究从冰岛硫化叶菌中纯化内源完整的Cmr-β复合物。该复合物解析得到2.75Å的Cryo-EM结构，该结构展示了Cmr-β复合物由7种不同亚基，共37个亚基和一条crRNA组成，组成成分比例为Cmr11-21-31-44-53-61-726-crRNA1。研究人员发现，与其他III型复合物不同的是，Cmr-β复合物的中心结构中的每个亚基均被由两个Cmr7形成的二聚体覆盖（如图1E和F）。该III-B型复合物是目前发现的亚基数最多，分子量最大的复合物。

图1. 冰岛硫化叶菌SisCmr-β冷冻电镜电镜结构

目前发现的III型系统具有的同源靶标RNA激活的活性是单链DNA切割活性和cOA合成活性。该研究首次发现，除了以上两种激活活性，Cmr-β复合物还同时具有非特异性单链 RNA 切割活性。

先前的研究表明，III-A型的Csm复合物通过Cas10家族蛋白—Csm1中的一个Linker和loop L1结构参与区分同源和非同源靶标RNA7。然而这些结构在III-B型的Cas10蛋白—Cmr2中并不保守。为了理解III-B复合物如何区分同源靶标RNA和非同源靶标RNA，避免自身免疫机制，研究人员纯化了靶标RNA切割活性失活的突变体（4βD31A-β），并解析了该突变体+非同源靶标RNA或同源靶标RNA的Cryo-EM结构（3.1 Å和3.5 Å）。通过结构比较发现，存在于Cmr3中的一个颈环（stalk loop）在这三个结构中呈现不同的构象：在复合物结构里呈现“延伸”，复合物结合非同源靶标RNA后发生旋转，呈“回缩”，结合同源靶标RNA后，消失“不可见”。通过序列比对发现，这个颈环结构保守的存在于III-B系统中。该研究指出，III-B复合物与非同源RNA结合后，其crRNA 5’ tag和非同源RNA 3’ antitag互补配对后，Cmr3中的颈环锁定在“回缩”状态，传达一种“自我”的信号，从而避免自身免疫。

为了进一步揭示同源靶标RNA激活Cmr-β复合物免疫的分子机制（即cOA合成，单链核酸切割），研究人员解析了4βD31A-β复合物+同源靶标RNA+AMP-PnP(ATP类似物)，并得到了两种状态的Cryo-EM结构，简称AMPPnP1（2.41Å）和AMPPnP2（2.68Å）。在此复合物的基础上再加上一条单链polyT DNA，同样得到了两种Cryo-EM结构（polyT1，3.07Å和polyT2，3.14Å）。在这些结构中，Cmr3颈环结构呈现不同的构像变化，“延伸”、“回缩”和“不可见”。

综上所述，不同状态下的多种结构中的颈环结构的构象变化表明，Cmr-β复合物在结合同源靶标RNA后，颈环结构在“延伸”和“回缩”的构型间交替，这种动态平衡似乎控制着Cmr2的活性，从而控制着免疫反应。

总体而言，该研究通过冷冻电镜技术解析了冰岛硫化叶菌中的Cmr-β复合物与不同底物结合后的七种高分辨率结构，结合生化实验数据表征该III-B CRISPR-Cas系统结合靶标RNA后，颈环结构的构象变化参与机体避免自身免疫以及响应免疫的机制。该研究为全面了解多样性的III型CRISPR-Cas系统的免疫机制蓝图增添了一份贡献。

图2. III-B型SisCmr-β复合物免疫机理模型

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