近日，bet365 코리아霍刘杰教授、武大雷教授课题组以及医学融合与实践中心闫杰教授课题组合作，采用异源生物合成策略，在黏细菌中发现并表征了一个新颖的羊毛硫肽生物合成基因簇mfu，成功获得并表征了其产物myxococins的化学结构与抗炎生物活性，解析了其新颖的生物合成机制。研究成果以“Discovery and Characterization of a Myxobacterial Lanthipeptide with Unique Biosynthetic Features and Anti-inflammatory Activity”为题在线发表于化学顶级期刊美国化学会会志Journal of the American Chemical Society（中科院一区，IF=16）。bet365 코리아博士研究生王晓彤和博士生陈晓宇为论文第一作者，bet365 코리아霍刘杰教授、武大雷教授与医学融合与实践中心闫杰教授为通讯作者。bet365 코리아为第一完成单位。
黏细菌为土壤来源的革兰氏阴性细菌，可产生丰富的天然产物，具有巨大的生物合成潜力。生物信息学分析显示，黏细菌基因组中存在许多核糖体肽类生物合成基因簇，但目前仅有少量黏细菌来源的核糖体肽类化合物被报道，因此黏细菌来源的核糖体肽类天然产物具有极大的挖掘潜力。羊毛硫肽类化合物是目前为止研究最为广泛的一类核糖体肽，具有多样的结构和生物活性。本研究通过生物信息学分析，在黏细菌Myxococcus fulvusMcy8288的基因组中发现了一个假定的羊毛硫肽生物合成基因簇mfu，其同时编码了Ⅱ型羊毛硫肽合成酶MfuM以及Ⅰ型羊毛硫肽环化酶MfuC，以及包含C39蛋白酶结构域的转运蛋白MfuT。值得注意的是，该基因簇还包含了一个未在核糖体肽类天然产物中表征过的M61家族肽酶MfuP（图1）。采用在大肠杆菌中前体肽与其共表达的策略，结果表明前体肽首先被MfuM的脱水结构域催化5个连续的苏氨酸残基的脱水，形成Dhb；紧接着MfuM的环化结构域发挥活性，完成Cys18、Cys20以及Cys31三个位点的环化；之后MfuC负责了剩余两个位点Cys33和Cys35的环化，形成复杂、交联的五环结构。这是首次发现Ⅰ型与Ⅱ型羊毛硫肽生物合成酶共同参与产物生成硫醚环的现象（图1）。通过Marfey、串联质谱及核磁联用，确定了脱水环化及前导肽切割后产物myxococinA的化学结构（图1）。
图1|myxococin的生物合成途径解析与化学结构表征。
随后，通过体外生化活性表征，确定了M61家族肽酶MfuP以严格的五环结构依赖的方式水解myxococin A中Ala32与Ser34 N端的两个酰胺键，发挥“解环”作用生成产物myxococin B（图1）。这是首次报道该类“解环”翻译后修饰过程发生在核糖体肽类天然产物的生物合成过程中，也是M61家族肽酶首次被发现参与核糖体肽的生物合成。基于其新颖性，作者进一步对MfuP进行了晶体结构的解析，并结合突变体工程确定了其活性位点（图2a-c）。结果显示MfuP与已知结构的M61家族氨肽酶IloAPN的整体结构类似，但是MfuP的底物结合槽腔体的体积远大于IloAPN（图2d），这与MfuP识别并结合myxococin A的复杂五环结构相对应。此外，本论文还通过建立MfuP与底物的结合模型（图2f），探究了MfuP假定的底物结合口袋以及MfuP与底物的相互作用。通过生物信息学分析发现，该类蛋白普遍编码于假定的核糖体肽类生物合成基因簇周围，暗示该类蛋白具有较大的挖掘潜力。
图2|MfuP的晶体结构解析。（a）MfuP的一级结构示意图；（b）以surface模式展示的MfuP整体结构；（c）MfuP三个结构域的cartoon模型；（d）MfuP、IloAPN（PDB:4FGM）以及EryP封闭构象（PDB:7V9N）和开放构象（PDB:7V9Q）的cartoon模型；（e）MfuP活性中心锌离子与活性位点关键氨基酸的相互作用示意图；（f）MfuP-myxococin A9-35的结合模式图
最后，作者对myxococin A和myxococin B进行了生物活性的检测，以LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为模型，发现其对NO的释放和诱导型NO合酶（Nos2），以及促炎细胞因子TNFα、IL6和IL1β在转录水平和蛋白水平上均具有明显的抑制效应，表明其良好的抗炎活性，且未检测到细胞毒性（图3）。该特性表明其具有进一步开发成为抗炎药物先导化合物的潜力，且其抗炎活性机制也值得进一步研究。
图3|myxococin A和B对RAW264.7细胞株的细胞毒性和抗炎活性检测。阳性对照：地塞米松
该研究得到包括bet365 코리아-亥姆霍兹国际实验室、国家重点研发计划，国家自然科学基金与山东省自然科学基金等项目资助。bet365 코리아生命环境研究公共技术平台为本工作提供了重要支持。
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